在体外，通过内源性激活剂而非外源性引发剂实现低含量癌症生物标志物的原位检测仍然是一个巨大的挑战，这在开发一种具有内源性蛋白酶可激活方式的肿瘤特异性纳米传感器方面留下了空白。在这里，我们提出了一种由肽核酸-肽-DNA共聚物引导的内源性蛋白酶可激活纳米传感器（PA-NS），通过结合电化学检测与活体肿瘤细胞的光学成像，实现了对miRNA-21（miR-21）的AND门控双模型感测，无需额外引入外源性激活剂或纳米材料。此外，PA-NS只能同时通过“双重钥匙”（肿瘤细胞中过表达的miR-21和半胱天冬酶B蛋白酶）激活，这使得肿瘤细胞与健康细胞比例的有效提高成为可能。在单个肿瘤细胞中测量的荧光强度比单个健康细胞高出约3.5倍，且在目标miRNA存在时，电化学反应降低了约30%。此外，对蛋白酶活性的调节和在外部刺激下miR-21波动的研究，有助于我们理解疾病发展背后的生物过程和药物筛选。这种特定的内源性蛋白酶介导的双模型miRNA检测方式保证了卓越的肿瘤选择能力，为研究细胞异质性提供了新的机会，并为癌症诊断和治疗提供了更可靠的基础，直至单细胞水平。